Protagonistas

Tobey Maguire como Peter Parker / Spider-Man: Un estudiante de fisica y fotografo del Daily Bugle, quien lleva una doble vida como el super héroe el Hombre Araña.
Kirsten Dunst como Mary Jane Watson: La amada de Peter Parker y recientemente actriz de Broadway.
James Franco como Harry Osborn / Nuevo Duende: Hijo del fallecido Norman Osborn y antiguo mejor amigo de Peter Parker. Cree que el Hombre Araña asesino a su padre. Harry se convierte en el Nuevo Duende.
Thomas Haden Church como Flint Marko / El hombre-arena: Un ladron a pequeña escala, quien dejo a una esposa y una hija enferma. Se convierte en El Hombre de Arena despues de un accidente.
Topher Grace como Eddie Brock, Jr. / Venom: Un fotógrafo del Daily Bugle quien se convierte en Venom.
Rosemary Harris como May Parker: La tia de Peter Parker y la viuda de Ben Parker, el tio Ben.
Bryce Dallas Howard como Gwen Stacy: Hija de un capitan de Policia y compañera de laboratorio de Peter Parker.
J. K. Simmons como J. Jonah Jameson: El editor agresivo del Daily Bugle. Considera a el Hombre Araña un criminal e intenta por todos los medios atacarlo.
Dylan Baker como Dr. Curt Connors: Un profesor de Fisica de la Universidad donde Peter Parker estudia.
James Cromwell como el capitán George Stacy: Capitan de Policia y el padre de Gwen Stacy.
Elizabeth Banks como Betty Brant: La secretaria de J. Jonah Jameson.
Willem Dafoe como Norman Osborn / Duende Verde: El padre muerto de Harry Osborn quien se aparece a su hijo en alucinaciones.
Cliff Robertson como Benjamin Parker: Asesinado durante un robo de auto, esposo de May Parker y tio de Peter Parker.